Racemisatie en D-aminozuren: het verborgen zuiverheidsprobleem in peptiden

In het kort

Racemisatie is het omklappen van een aminozuur van de natuurlijke L-vorm naar de spiegelbeeldige D-vorm tijdens peptidesynthese. Het ontstaat vooral bij het activeren van een aminozuur voor koppeling, en cysteine en histidine zijn het gevoeligst. Het resultaat heeft exact dezelfde massa, dus massaspectrometrie ziet het niet en een standaard HPLC-meting niet altijd. Chirale zuiverheid wordt gemeten na hydrolyse, bijvoorbeeld met de methode van Marfey.

Een peptide kan 99 procent zuiver scoren en toch niet helemaal de juiste stof zijn. Bij de synthese kan een aminozuur omklappen naar zijn spiegelbeeld: dezelfde atomen, een andere ruimtelijke vorm. Dat heet racemisatie, en een standaard HPLC-meting ziet het niet altijd.

In deze gids lees je wat chiraliteit is, hoe racemisatie tijdens de synthese ontstaat, welke aminozuren gevoelig zijn en hoe chirale zuiverheid wordt gemeten.

Nog zoekende naar het juiste materiaal? De gratis Peptidewijzer zet in een paar vragen op een rij welke research peptiden bij jouw onderzoeksvraag passen.

L en D: links- en rechtshandige aminozuren

Negentien van de twintig standaard aminozuren zijn chiraal: ze bestaan in twee vormen die elkaars spiegelbeeld zijn, zoals een linker- en een rechterhand. De natuur gebruikt bijna uitsluitend de L-vorm. Alleen glycine heeft geen spiegelbeeld, omdat het geen zijketen heeft.

Neem BPC-157, met de sequentie GEPPPGKPADDAGLV. Van de vijftien aminozuren zijn er drie glycine. De andere twaalf zijn chiraal, en elk daarvan moet in de L-vorm in de keten zitten. Klapt er een om, dan heb je een andere stof met dezelfde formule.

Hoe racemisatie tijdens de synthese ontstaat

Bij vastefase-peptidesynthese wordt de keten aminozuur voor aminozuur opgebouwd. Om een nieuw aminozuur te koppelen, wordt de zuurgroep ervan geactiveerd. In die geactiveerde toestand kan het waterstofatoom op het chirale centrum tijdelijk loskomen, vaak via een tussenstof die oxazolon heet. Komt het terug aan de andere kant, dan is het aminozuur omgeklapt.

Factor	Effect op racemisatie
Cysteine en histidine in de keten	het gevoeligst, bekend uit de synthesepraktijk
Sterke base tijdens koppelen	verhoogt het risico
Lange activeringstijd	verhoogt het risico
Hoge temperatuur, ook bij microgolfsynthese	verhoogt het risico bij gevoelige residuen
Additieven zoals Oxyma of HOBt	verlagen het risico
Koppelen aan een segment in plaats van een enkel aminozuur	verhoogt het risico aanzienlijk

Han, Albericio en Barany beschreven al in 1997 in het Journal of Organic Chemistry hoe gevoelig cysteine is bij stapsgewijze synthese, en welke koppelingscondities dat beperken. Het overzicht van El-Faham en Albericio in Chemical Reviews vergelijkt koppelingsreagentia onder meer op dit punt.

Waarom gangbare tests het missen

1. Massaspectrometrie ziet het niet

Een D-aminozuur heeft precies dezelfde atomen als het L-aminozuur. De massa van het peptide verandert dus niet. Massaspectrometrie bevestigt de juiste massa, ook als er een aminozuur is omgeklapt.

2. HPLC ziet het soms

Een peptide met een omgeklapt aminozuur is een diastereomeer van het origineel. Diastereomeren gedragen zich iets anders op een HPLC-kolom en worden vaak, maar niet altijd, als aparte piek gescheiden. Valt de piek samen met de hoofdpiek, dan telt hij mee als zuiver product.

Hoe chirale zuiverheid wordt gemeten

Hydrolyse. Het peptide wordt in zuur afgebroken tot losse aminozuren. Omdat de hydrolyse zelf ook wat racemisatie veroorzaakt, wordt die vaak in gedeutereerd zuur uitgevoerd, zodat nieuw ontstane D-vormen herkenbaar zijn.
Derivatisering. Bij de methode van Marfey worden de aminozuren gekoppeld aan een chiraal reagens. L- en D-vormen worden daardoor diastereomeren die op een gewone HPLC-kolom te scheiden zijn.
Chirale chromatografie. Als alternatief worden de aminozuren gescheiden op een chirale GC- of HPLC-kolom.

De uitkomst is een percentage D-vorm per aminozuur. Dat is aanvullende informatie naast de standaard HPLC-zuiverheid en wordt vooral gevraagd bij referentiemateriaal en bij peptiden met cysteine of histidine.

Wanneer D-aminozuren juist de bedoeling zijn

Niet elk D-aminozuur is een fout. Sommige onderzoekspeptiden bevatten bewust een D-aminozuur, omdat de keten daardoor minder snel door enzymen wordt afgebroken. In de natuur komen ze ook voor, bijvoorbeeld in dermorfine, een peptide uit de huid van een kikkersoort. In de sequentie staat zo’n bewuste D-vorm aangegeven, bijvoorbeeld als D-Ala. Het verschil met racemisatie is dat het dan een ontwerpkeuze is en geen bijproduct.

Veelgestelde vragen

Wat is racemisatie bij peptiden?

Het omklappen van een aminozuur van de L-vorm naar de spiegelbeeldige D-vorm tijdens de synthese. Het ontstaat vooral bij het activeren van een aminozuur voor koppeling.

Welke aminozuren zijn het gevoeligst voor racemisatie?

Cysteine en histidine. Ook segmentkoppelingen, sterke base en hoge temperatuur verhogen het risico.

Ziet massaspectrometrie een D-aminozuur?

Nee. Een D-aminozuur heeft dezelfde massa als de L-vorm, dus de massa van het peptide verandert niet.

Hoe wordt chirale zuiverheid gemeten?

Na hydrolyse van het peptide tot losse aminozuren, bijvoorbeeld met de methode van Marfey of op een chirale kolom. De uitkomst is een percentage D-vorm per aminozuur.

Is elk D-aminozuur in een peptide een fout?

Nee. Sommige peptiden bevatten bewust een D-aminozuur voor meer stabiliteit tegen enzymen. Dat staat dan in de sequentie aangegeven.

Bestellen en bezorging in Nederland

Chempeptides levert in heel Nederland, met een levertijd van doorgaans een tot twee werkdagen naar onder meer Amsterdam, Rotterdam, Den Haag, Groningen, Wageningen en Eindhoven. Bestellingen die voor 12:00 uur op een werkdag binnen zijn, gaan nog dezelfde dag op transport. Binnen Nederland verzenden we gratis vanaf 200 euro, onder dat bedrag zie je het tarief in de winkelwagen.

Bestellen en betalen binnen de EU

Ook buiten Nederland leveren we in de hele EU, in neutrale verpakking zonder opdruk en altijd met track and trace. Wil je gekoeld verzenden, kies dan bij het afrekenen voor cold packs. Voor bestellingen buiten Nederland gelden de normale verzendtarieven, die je terugvindt op de verzendpagina.

Kwaliteitscriteria voor research grade

HPLC-zuiverheid van minimaal 99 procent, geverifieerd per batch
Massaspectrometrische bevestiging van de moleculaire identiteit
Certificaat van analyse beschikbaar bij elke bestelling
Verzegeld en batch-getraceerd, van productie tot aflevering
Gekoeld verzenden met cold packs mogelijk
Discrete verzending in neutrale verpakking

Betalen met iDEAL of Wero bij Chempeptides

Reken veilig af met iDEAL of Wero, rechtstreeks vanuit je eigen bankomgeving. Je ziet het exacte bedrag en je ordernummer voordat je bevestigt, en de betaling wordt direct verwerkt zodat je bestelling nog dezelfde werkdag klaargemaakt kan worden. Voor onderzoeksgroepen die met een inkoopordernummer werken is facturatie op aanvraag mogelijk.

Conclusie

Racemisatie levert een peptide op met de juiste massa maar de verkeerde ruimtelijke vorm. Massaspectrometrie ziet het niet en HPLC niet altijd. Chirale analyse na hydrolyse maakt het wel zichtbaar, en is vooral relevant bij peptiden met cysteine of histidine en bij referentiemateriaal.

Wie kwaliteit serieus beoordeelt, kijkt verder dan het zuiverheidspercentage alleen. Bekijk het assortiment onderzoekspeptiden met certificaat per batch, zoals SS-31 en TB-500.

Belangrijke bronnen:

Han Y, Albericio F, Barany G. Occurrence and minimization of cysteine racemization during stepwise solid-phase peptide synthesis. Journal of Organic Chemistry, 1997;62(13):4307-4312.
El-Faham A, Albericio F. Peptide coupling reagents, more than a letter soup. Chemical Reviews, 2011;111(11):6557-6602.
Marfey P. Determination of D-amino acids. II. Use of a bifunctional reagent, 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzene. Carlsberg Research Communications, 1984;49(6):591-596.

Twijfel je of heb je vragen over je gezondheid?Raadpleeg altijd betrouwbare medische bronnen of je huisarts.Thuisarts.nl Apotheek.nl

Research disclaimer▾

Alle informatie op deze pagina is bedoeld voor laboratoriumonderzoek en in-vitro studies. Geen humane consumptie. Geen medische claims. Producten zijn niet goedgekeurd door EMA of FDA voor therapeutisch gebruik.